بهینه سازی استخراج ترکیبات فنلی، آنتوسیانین و بازده عصاره و بهینه یابی میزان اثر قدرت احیاکنندگی آهن

چکیده

در جامعه امروزی صنعت غذا استفاده از روغن ها گسترش زیادی پیدا کرده و در بسیاری از مواد غذایی کاربرد دارد. جلوگیری از اکسیداسیون این مواد غذایی تبدیل به دغدغه ای گردیده است. آنتی اکسیدان ها ترکیباتی هستند که سرعت اکسیداسیون چربی ها و تولید رادیکال آزاد را بسیار کاهش می دهد. آنتی اکسیدان های سنتزی در بسیاری از مواد غذایی حساس به اکسیداسیون استفاده می شوند. تاثیرات نامطلوب این آنتی اکسیدان های مصنوعی برای سیستم بدن انسان به اثبات رسیده است. به همین منظور شناخت ترکیبات گیاهی که خاصیت آنتی اکسیدانی داشته باشند اهمیت زیادی پیدا کرده است. گیاه ریحان قرمز دارای خاصیت آنتی اکسیدانی بالا می باشد و این تاثیرات مطلوب آن به اثبات رسیده است. هدف از این پژوهش تعیین بیشینه قدرت مهار رادیکال آزاد DPPH، آنتوسیانین، خاصیت احیاکنندگی آهن، مقدار ترکیبات کل و بازده استخراج عصاره توسط امواج دهی فراصوت بود. برای بهینه سازی فرآیند در آزمونها ۲ فاکتور زمان ۴۰)،۲۵،۱۰دقیقه) و دما ۷۰)،۵۵،۴۰ درجه سانتی گراد) مورد بررسی قرار گرفت. این طرح در ۲ فاکتور و سه سطح که شامل ۱۳ آزمون است، توسط روش سطح پاسخ انجام شد. نتایج حاصل از آنالیز آماری جهت تعیین حالت بهینه کل با در نظر گرفتن هر ۵ آزمون حاکی از آن بود که شرایط بهینه برای استخراج عصاره ریحان قرمز، زمان ۴۰ دقیقه و دما ۶۲٫۸۲ می باشد. مقدار غلظت آنتوسیانین، میزان بازده استخراج، قدرت احیاکنندگی آهن، مقدار ترکیبات فنولی کل، همچنین مقدار EC50 که رابطه عکس با قدرت مهار رادیکال آزاد DPPH دارد در نقطه بهینه به ترتیب برابر با ۹٫۶۴۷۴۰۷ ، ۷٫۸۰۴۹۸۹، ۵۸۲٫۹۴۰۴ ، ۳۹۲۲٫۴۸۵ ، ۳٫۸۵۱۱۶۱

گزارش شد.

کلمات کلیدی: ریحان قرمز، sonication، استخراج، آنتوسیانین، آنتی اکسیدان.

-۲ مقدمه

اکسایش لیپیدی از جمله مشکلات عمده در استفاده از روغن ها و چربی ها در حین فرآوری مواد غذایی است که باعث تولیـد مواد مضر به ویژه در دماهای بالا در آنها می شود و سلامت انسان را به خطر می اندازد؟ افزایش پایداری اکسایشی روغن هـا و چربی های خوراکی کاری است که در حل این مشکل توصیه می شود (شاد دل و همکاران، .(۱۳۹۰

اکسیداسیون روغن ها در طی فرآوری غذاها نه تنها باعث از دست رفتن ارزش تغذیه ای می شـود بلکـه فـرآورده هـایی ماننـد رادیکال آزاد تولید می کند. با توسعه علم بیوشیمی نقش موثر رادیکـال هـای آزاد در بسـیاری از بیمـاری هـا از جملـه تصـلب شرایین، سرطان و پیری زودرس مشخص شده است (احمدی و همکاران، .(۲۰۰۷

آنتی اکسیدان ها باعث به تأخیر افتادن اکسایش روغنها و چربی ها و کاهش تولید رادیکال های آزاد می شوند. آنتی اکسـیدان ها به دو دسته عمده طبیعی و سنتزی طبقه بندی می شوند. انواع طبیعی دارای ساختار فنلـی (فلاونوئیـدها، توکـوفرول هـا و اسیدهای فنلی)، ترکیبات نیتروژنی (آلکالوئیدها، مشتقات کلروفیل، اسیدهای آمینه و آمین ها) یا کاروتنوئیدها می باشند. انواع سنتزی به طور عمده ترکیبات فنلی هستند که می توان به بوتیلات هیدروکسی تولوئن (BHT)، بوتیلات هیدروکسی آنیـزول (BHA)، ترت بوتیل هیدروکینون (TBHQ)، پروپیل گالات (PG) اشاره کرد کـه بـه طـور وسـیعی در بسـیاری از غـذاها و فرآورده های غذایی پرچرب استفاده می شوند و عوارض نامطلوب مصرف این دسته از آنتی اکسیدان ها به اثبات رسـیده اسـت (مهدوی و همکاران، .(۱۹۹۵

تحقیقات انجام شده حاکی از این است که برخی آنتی اکسیدان های سنتزی دارای آثار فیزیولوژیکی نامطلوبی در انسان می باشند، به همین علت آنتی اکسیدان های طبیعی به ویژه در دو دهه ی اخیر به شدت مورد توجه قـرار

گرفته اند (شریف و همکاران، ًًٍُ ) . به علت محدود بودن اغلب منابع آنتی اکسیدانی طبیعی، همچنین کارایی پایین برخی از آنها نظیر توکوفرول ها، شناسایی منابع آنتی اکسیدانی دیگر امری مهم به نظر می رسد.

گیاه ریحان قرمز در ایران به وفور کشت می شود و وجود ترکیبات فنولیک و خاصیت آنتی اکسیدانی آن به اثبات رسیده است. در سال های اخیر به دلیل اثرات نامطلوب داروهای سنتزی، توجه زیادی به استفاده از گیاهان دارویی در سراسر جهان صـورت گرفته است. بنابراین ضروری است که در مبحث استفاده از گیاهان دارویی و فرآورده های آن ها پژوهش هـای نـوین و کـاملی انجام شود. در تحقیق حاضر از انواع روش های استخراج، تأثیر روش استخراج به کمک فن آوری اولتراسوند۱ بـر قـدرت آنتـی اکسیدانی و مقدار ترکیبات فنلی گیاه ریحان قرمز مورد بررسی قرار گرفته است.

-۳ مواد و روش ها

-۱-۳ آماده سازی مواد اولیه:

گیاه ریحان قرمز رسیده گونه Ocimum basilicum در اردیبهشت ماه ۸۲ از محل پرورش در سبزوار تهیه گردید. صحت گیاه شناختی گونه ی مورد مطالعه توسط باغ گیاهشناسی ملی (تهران) تایید شد. برگ های سبز و قرمز از یکدیگر جدا گردید. فقط برگ های قرمز در بسته بندی پلاستیکی چهار لایه قرار گرفته و در دمای -۱۸ درجه سانتی گراد فریز گردید.

-۲-۳ استخراج به کمک اولتراسوند:

نمونه از فریزر خارج شد.مقدار لازم وزن شده و با حلال اتانول- اسید کلریدریک ۰٫۱نرمال (۱۵ : ۸۵) به نسبت ۱ به ۴ با هـم مخلـوط گردیدنـد و درون دسـتگاه حمـام اولتراسـونیک BANDELIN SONOREX digitec) مـدل DT 510 H ساخت آلمان) در دماهای مختلف ۴۰ )، ۵۵ و ۷۰ درجه سانتی گراد)، و زمـان هـای ۱۰)، ۲۵ و ۴۰ دقیقـه) در معـرض امـواج اولتراسوند با شدت ثابت قرار گرفتند. توان دستگاه ۳۵ KHZ بود. سپس عصـاره اسـتخراج شـده بـا اسـتفاده از کاغـذ صـافی

۱- Ultrasound

واتمن۲ شماره (Slow) 5 و پمپ خلاء از مواد جامد گیاهی جدا گردید و در مرحله بعد به منظور حـذف حـلال، عصـاره هـای حاصل در دستگاه روتاری۳ (مدل Laborota 4002/4003 control ساخت شرکت هایدولف آلمان) تحـت عملیـات تقطیـر در خلاء قرار گرفتند. در این مرحله از دمای ۴۵- ۴۰ درجه سانتی گراد استفاده شـد تـا میـزان آسـیب دیـدن ترکیبـات آنتـی اکسیدانی و ترکیبات فنولیک به حداقل برسد. در نهایت عصاره به پلیت های شیشه ای منتقل شده و روی بن مـاری در دمـای ۵۰-۴۵ درجه سانتی گراد باقیمانده حلال حذف شد و عصاره ها خشک شدند، تا حدی که دیگـر سـیال نبودنـد. سـپس درب پلیت ها را بسته و دور آن را به منظور جلوگیری از نور با فویل آلومینیومی پوشانده، در پوشش ۴ لایه پلاستیکی قرار گرفـت و در فریزر -۱۸ درجه سانتی گراد تا زمان آزمون نگهداری شـدند (پـدرام نیـا و همکـاران، ۱۳۸۹؛ بهمـن آبـادی و همکـاران، .(۱۳۹۰

-۳-۳ اندازه گیری شدت آنتوسانین ها به روش pH افتراقی

Fuleki و Fransis در سال ۱۹۶۸ برای اندازه گیری آنتوسیانین از روش اختلاف در جذب طول موج در دو pH مختلف استفاده کردند که برای اندازه گیری آنتوسیانین روش مطلوبی به نظر می آید. این روش بر اساس اختلاف جذب بین دو طول موج آنتوسیانین غالب و طول موج ۷۰۰ نانومتر در pH= 1 (کلرید پتاسیم) و ) pH=4/5 سدیم استات) می باشد Fransis) و Fuleki در سال ۱۹۶۸ موجود در pdf اکرم شریفی). آنتوسیانین غالب در گیاه ریحان قرمز، سیانیدین–۳,۵گلایکوزید بود که لاندا ماکزیمم آن ۵۲۰ نانومتر بود.
∆a= [(A 520 – A700) pH =1] – [ (A 520 – A700) pH=4/5]

C=∆a × M × D / Ɛ × L

=C شدت آنتوسیانین
=M جرم مولکولی آنتوسیانین غالب =D فاکتور رقیق کردن

= L طول سل =Ɛ جذب مولی

-۴-۳ اندازه گیری میزان ترکیبات فنولی

مقدار ۵ میلی گرم عصاره در متانول حل شد و ۲/۵ میلی لیتر معرف فولین سیوکالچو به آن اضافه گردید (فولین ۱ به ۱۰ با آب مقطر ) پس از اختلاط به مدت ۳ دقیقه در حالت سکون قرار داده شد تا واکنش صورت پذیرد. در ادامه ۵ میلی لیتر کربنات سدیم ۷/۵ درصد به فاز آبی اضافه و بعد از یک دقیقه با آب مقطر به حجم ۵۰ میلی لیتر رسانده شد. نمونه در طول شب ۲۴) ساعت) نگهداری و سپس جذب آن در طول موج ۷۶۵ نانومتر خوانده شد و مقدار ترکیبات فنولی بر حسب میلی گرم در کیلوگرم نمونه بر طبق فرمول زیر محاسبه گردید (بهمن آبادی و همکاران، .(۱۳۹۰

۱- Whatman filter paper 2- Rotary

۰٫۴
Y = 1/0776X2 + 0/2644X + 0/0099 0.35
R2 = 0/9922 پلي
۰٫۳
فنلها
۰٫۲۵
)ميلي
۰٫۲
به گرم
۰٫۱۵
ميلي
۰٫۱
ليتر(

۰٫۰۵
۰
۰٫۵ ۰٫۴ ۰٫۳ ۰٫۲ ۰٫۱ ۰

جذب

شکل -۱ منحنی کالیبراسیون غلظت ترکیبات پلیفنلی در برابر جذب خوانده شده در طول موج ۷۶۵ نانومتر

P= Y / W × ۱۰۰۰

=P مقدار ترکیبات فنولی نمونه بر حسب میلی گرم بر میلی لیتر =W وزن نمونه