چکیده
یک روش استخراج با فاز جامد (SPE) به منظور پاکسازی و پیش تغلیظ شاخص های فلاونوئیدی (اریوسیترین و هسپریدین) از آب لیموهای ایرانی و اندازه گیری آنها با روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا انجام و نتایج حاصله با هم مقایسه شدند . شرایط بهینه برای استخراج فاز جامد با استفاده از ۶ میلی لیتر مخلوط آب /متانول pH=2.5)،(۹:۱ V/V به عنوان حلال شستشو و ۴ میلی لیتر متانول برای شویش نمونه بدست آمد . آماده سازی، پاکسازی و بازیابی بالای ۹۰% برای تمام آنالیتها مشاهده گردید . استفاده از فاز متحرک آب /استونیتریل/استیک اسید V/V)، ۱ْ۲۱ْ(۷۸ به عنوان فاز متحرک بهینه امکان جداسازی آنالیتها را از دیگر ترکیبات مزاحم موجود در آب لیمو مهیا نمود.
واژه های کلیدی : اریوسیترین، هسپریدین، آب لیمو ترش، استخراج فاز جامد، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
مقدمه
فلاونوئیدها پلی فنول های مهمی هستند که به طور گسترده ای در گیاهان دارویی و مواد غذایی با ماهیت گیاهی (که عمدتا دارای طعم و رنگ میوه ها و سبزیجات می باشند ) وجود دارند. فلاونوئیدهای گلیکوزیدی می توانند به عنوان شاخص های اختصاصی و حساس در عیارسنجی و تعیین تقلب آب میوه ها، آب لیمو، عصاره مرکبات و همچنین تشخیص اختلاط و مخلوط کردن غیرمجاز و تقلبی آب مرکبات با یکدیگر (مانند مخلوط کردن و تقلب در آب پرتقال بوسیله آب گریپ فروت ) به کمک روش های تجزیه ای حساس که اکثر آنها بر اساس روش های کروماتوگرافی مایع (به ویژه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) می باشند، مورد استفاده قرار بگیرند . اریوسیترین (Eriocitrin) و هسپریدین (Hesperidin) ترکیبات گلیکوزیدی (دارای یک شاخه قندی ) متعلق به گروه فلاوانونها می باشند که جزو اولین و اصلی ترین پلی فنولهای شناسایی شده در آب لیمو می باشند . این ترکیبات آنتی اکسیدان های بالقوه، از بین برنده رادیکال ها [۱] و کی لیت سازهای فلزی [۲] می باشند. این ترکیبات از اکسیداسیون چربی ها جلوگیری نموده [۳] و فعالیت های فیزیولوژیکی گسترده ای را از خود نشان می دهند ۵]و. [۴ به علت اهمیت فلاونوئیدها به عنوان مواد مؤثر در سلامتی انسان که در مرکبات وجود دارند، اندازه گیری این ترکیبات موجود در میوه مرکبات نقش مهمی را در بسیاری از حوزه های علمی ایفا می کند . آب لیمو ترش بواسطه مقادیر قابل توجهی از فلاونوئیدها ( اریوسیترین و هسپریدین ) قابل شناسایی می باشند.
روش های آماده سازی متعددی مانند هیدرولیز [۷] ، صاف کردن و رقیق سازی [۸ ]، استخراج مایع [۹] ، استخراج با کمک امواج فراصوت [۱۰] و استخراج فاز ساکن [۱۱] جهت اندازه گیری ترکیبات فلاونوئیدی در آب لیمو به وسیله روش های کروماتوگرافی توسعه یافته اند . [۱۲-۱۸]
فرایند استخراج فاز ساکن (SPE) شامل جداسازی و پیش تغلیظ آنالیت از یک ماتریکس پیچیده بر اساس جذب سطحی بر روی یک جاذب مناسب، حذف ناخالصی های مزاحم بوسیله شستشو با یک سیستم حلال مناسب و بازیابی انتخابی آنالیت بازداری شده بوسیله یک حلال مناسب می باشد . C18 می تواند یک جاذب مناسب برای جداسا زی فلاونوئیدها با قطبیت های متفاوت باشد.
هدف از این مطالعه ارائه و توسعه یک روش استخراج فاز ساکن ترکیب شده با HPLC برای اندازه گیری هم زمان اریوسیترین و هسپریدین می باشد . این روش به منظور اندازه گیری فلاونوئیدهای ذکر شده در نمونه های آب لیمو ترش از نقاط مخ تلف کشور به کار گرفته شد.
-۲ بخش تجربی
-۱-۲ مواد شیمیایی مصرفی:
نام مواد شیمیایی مصرف شده، همراه با کد، درجه خلوص و شرکت سازنده آنها در جدول (۱) آورده شده است.
جدول(:(۱ مواد شیمیایی مورد استفاده
کد نام ماده شیمیایی درصد خلوص شرکت سازنده
۱ متانول HPLC grade ≤%۹۹/۸ فلوکا سوییس
۲ استونیتریل HPLC grade ≤%۹۹/۸ فلوکا سوییس
۳ اریوسیترین %۹۹+ سیگما – آلدریچ
۴ هگزان نرمال %۹۹ مرک آلمان
۵ اسید فسفریک %۸۵ مرک آلمان
۶ اسید استیک %۹۹ مرک آلمان
۷ سدیم استات %۹۸ مرک آلمان
۸ سود %۹۸ مرک آلمان
۹ هسپریدین %۹۸ سیگما – آلدریچ
۱۰ هیدروکلریک اسید %۳۲ مرک آلمان
۱۱ استن HPLC grade ≤%۹۹/۸ فلوکا سوییس
۱۲ اتیل استات %۹۹ مرک آلمان
۱۳ دی اتیل اتر %۹۹/۵ مرک آلمان
۱۴ -۲پروپانول %۹۹/۷ مرک آلمان
۱۵ آب دو بار تقطیر – –
-۲-۲ دستگاهها:
-۱-۲-۲ دستگاه HPLC
اجزاء دستگاه HPLC شامل موارد زیر است:
الف) پمپ: وسیله ای است که فاز متحرک را به جریان می اندازد، پمپ باید بتواند فاز متحرک را به طور تکرار پذیر و یکنواخت با سرعت جریان ثابت در ستون هدایت کند.
ب) مخزن های حلال: از شیشه یا استیل زنگ نزن بوده و مجهز به میکرو فیلتر جهت ممانعت از ورود ذرات ریز احتمالی موجود در فاز متحرک است.
ج) سیستم تزریق نمونه: برای به دست آوردن حداکثر کارایی در کروماتوگرافی، نمونه باید به صورت نوار بسیار باریک از سر ستون وارد شود. سیستم تزریق نمونه به همین منظور طراحی شده است. در این سیستم، یک لوپ، در نظر گرفته شده است که می توان حجم نمونه تزریقی به ستون را توسط آن کنترل کرد. حجم لوپ می تواند بین ۲ میکرولیتر تا ۲۰ میلی لیتر بسته به نوع کار تغییر کند.
